流式(Flow)资源包:精彩录制视频、常见20问、PPT大放送!附彩蛋~

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来源:Cell Signaling Technology (CST)2020-6-28 访问量:653评论(0)

胞内染色染不出?找不到合适的抗体?修饰蛋白不知道怎么刺激?流式问题层出不穷,近日,Cell Signaling Technology(CST) 做了一场备受欢迎的流式细胞术线上讲座,跳出墨守陈规的定律,更深层挖掘实验和应用,助力科研及临床的发展。

该讲座的独到之处,在于讲授了流式的精髓的同时,也带大家领略CST流式产品在细胞通路研究的独到之处,错过了该精彩绝伦的讲座的你,就不要再错过此次资源放送大礼包:讲座回放视频、现场Q&A、讲座PPT、知识彩蛋等。欢迎传阅!

一、讲座回放视频

点击上图,观看讲座视频

二、直播现场问答

请详细阅读学习,或许你也正有此疑问Q1:“您说Fc blocking,如果我想检测CD16,还能加Fc blocking吗?”

A:这个要看您Fc blocking里CD16的克隆,跟您检测用的CD16的克隆不能一样。另外建议预实验试一下。

Q2:“ 您对免疫器官比如脾脏的单细胞悬液制备有什么建议吗?前面只讲了血液和细胞系。”
A:脾脏制备单细胞悬液相对比较简单,只需用相应的器具将脾脏碾碎,再使用相应孔径的滤膜将单细胞滤出即可。比如可以使用注射器中的推柄将脾脏碾碎,PBS重悬后,用70μm的滤膜过滤至50 ml离心管中,离心去除上清。如需裂红,可再继续使用红细胞裂解液裂红。裂红时注意需要在冰上操作,5min 即可,时间不宜过长,避免裂红过度。5min 后,立即加入含有5%BSA的PBS终止裂红,再进行离心去除上清。
Q3:“ 您对免疫器官比如脾脏的单细胞悬液制备有什么建议吗?前面只讲了血液和细胞系。”
A:脾脏制备单细胞悬液相对比较简单,只需用相应的器具将脾脏碾碎,再使用相应孔径的滤膜将单细胞滤出即可。比如可以使用注射器中的推柄将脾脏碾碎,PBS重悬后,用70μm的滤膜过滤至50 ml离心管中,离心去除上清。如需裂红,可再继续使用红细胞裂解液裂红。裂红时注意需要在冰上操作,5min 即可,时间不宜过长,避免裂红过度。5min 后,立即加入含有5%BSA的PBS终止裂红,再进行离心去除上清。
Q4:“为什么CD8用了foxp3的破膜试剂?是表面marker不需要吧? ”
A:这里可能听课的同学有些误解。讲座中关于这个表格的使用,其目的是为了验证“这些固定破膜剂在对细胞进行处理之后,会不会对相应的靶点产生影响”这个问题。因此,并不是CD8标记的时候要使用Foxp3的破膜试剂,而是为了验证使用Foxp3固定破膜剂后,是否会影响CD8的表达。
Q5:“ GFP/PI做细胞周期,怎么做对照呢?”
A:1. 单纯做细胞周期,因为仅染色DNA,所以不需要额外准备未染色对照。需要准备的主要是生物学对照,以验证处理方法是否会引起细胞周期各个阶段的表现。2. 细胞周期经典的固定破膜方法还是使用乙醇。如果是使用乙醇对细胞进行处理,同样的道理,醇类的有机试剂会造成某些蛋白构象的变化,乙醇也会造成GFP的构象变化,造成GFP信号的淬灭。因此实验本身也变成了PI单染,也无需准备荧光类的对照。3. 如果不使用乙醇固定破膜(请注意,这类方法细胞周期使用不推荐),则需准备GFP单阳的细胞及PI单染的细胞来调节补偿。
Q6:“ RNA 探针可以做流式检测吗?”
A:目前市面上是有专门的用流式来检查RNA的产品。但是这些探针都是经过特殊设计的,有复杂又特殊的步骤,而且搭配其专用的固定破膜试剂。具体的详细信息大家可以咨询相应的品牌技术。
Q7:“ TritonX-100打孔,背景荧光强度高,是怎么造成的呢?”
A:这个原因有很多,可能跟检测的靶点及抗体克隆都有关系。如讲座中的两个不同的靶点,CD3和CD4,CD4的背景荧光就没有升高。
Q8:“ 某种目的蛋白(如核转录因子)本身的表达水平较低,如何成功检测出来?”
A:对于表达水平较低的靶标蛋白,可以通过配色来优化,比如选择亮一点的荧光染料。也可以通过选择生物素标记的一抗,再使用荧光偶联的链霉亲和素,这样可以起到放大的作用。但是,每种检测手段都有它的检测灵敏度的下限,如果靶标蛋白表达很低,即便是优化了抗体标记,也确实是有可能检测不到的。
Q9:“ 在哪里能查到某种目的蛋白的抗原表位是位于核内还是胞内?”
A:大家可以使用UniProt数据库。在CST官网上,进入目的抗体页面后,在页面最下方的数据库链接里可以直接进到相应靶标的网站。
Q10:“ FoxP3的固定破膜试剂具体成分是什么?”
A:Foxp3因为靶标本身检测的特殊性,所以目前各个品牌针对Foxp3的商业化固定破膜试剂具体成分都是不公开的。
Q11:“ 请问分离单细胞悬液后,因为在刺激阶段时间较长(4-6h),刺激后细胞又抱团,导致后续操作都是带有较大团沉淀操作,如何解决呢?”
A:1. 如果是贴壁细胞系样品,贴壁细胞可以先刺激后,再将细胞处理(如Accutase等)成单细胞悬液。2. 如果是其他已获取的单细胞悬液,则可以用枪进行吹匀。3. 注意刺激后样品的后续步骤,尽量在冰上进行,低温可以降低细胞的生命活动,在一定程度上可以保护刺激后得到的特殊靶标信号。
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三、CST额外赠送流式中常见问题

Q12:“ 如何合理使用并查找合适的同型对照(Isotype)?”
A-1:合理使用:1. 如果是阴性阳性分群明显的CD分子,抗体标记后即便没有Isotype也可以看到清楚的分群,则无需使用Isotype。2. 连续表达的靶标蛋白,以及没有明显阴性阳性分群的靶标蛋白,必须使用Isotype。3. CST大多数的靶标蛋白使用流式检测时都需使用Isotype。4. 标记时,Isotype Control的浓度必须与其对应靶标抗体的浓度一致。
A-2:查找同型对照:5. 在CST官网输入相应的抗体货号,在结果示意图下方的注释中即可看到对应的同型对照。如此种方法无法查到合适的同型对照,则请通过4006-473287 (GreatQ) 及tech@cst-c.com.cn联系技术支持团队。6. Isotype的来源与亚型必须与其对应靶标抗体的来源及亚型一致。

Q13:“ 如何刺激及活化靶标蛋白?”
A:CST官网上有非常详细的各种靶标的处理方式,大家可以通过以下链接进行查看并参考:cst-science.com/positivecontrol 如果需要更详细的信息,也可以通过4006-473287(GreatQ)及tech@cst-c.com.cn联系技术支持团队。

Q14:“ 如何选择及合理使用死活染料?”
A-1:胞内染料有两种,特点分别如下:1. 细胞膜非通透性核酸染料,该类型染料的特点是,仅标记核酸,不具有膜通透性,所以无法进入细胞膜完整的活细胞,只能进入细胞膜受损的死细胞。优点是操作简单,对于普通表面染色且细胞状态较好的样品,上机前10min加入即可。这类染料的缺点是,与核酸结合可逆,因此染色后的样品不可固定,否则可能会造成原本活细胞的二次着色,仅适合做新鲜的活细胞样本。2. 胺基结合类死活染料,该类型染料可以标记蛋白上的胺基。这种结合是稳定的,因此可以在死活染料标记后进行样本固定,适合胞内染色。
A-2:死活细胞染色注意事项:1. 组织样本如消化后得到单细胞悬液,则需使用胺基类染料。2. 胺基类染料染色时,染色缓冲液需使用纯PBS,不可含有FBS或BSA。以防止胺基类染料被非特异性结合,导致样本标记失败。
Q15:“ 甲醇固定有哪些注意事项?”
A:1. 样本沉淀一边涡旋,一边将-20℃预冷的纯甲醇,缓慢逐滴加入,直至相应浓度。2. 需使用水平转子进行离心,离心力500 g。
Q16:“ 当检测的靶标既有表面又有胞内蛋白时该如何确定合适的实验步骤?”
A:1. 首先,分析胞内样品是否需要刺激,刺激的时间大约到多久。如果刺激时间很短,则需先进行死活染料的标记,然后刺激样品,完成刺激后最好即刻进行固定。2. 查看固定试剂对表面待测靶标的影响。如果固定会引起表面待测靶标的抗原位点被遮蔽,则需先进行表面靶标的标记再固定。3. 根据胞内待测靶标确定可以使用的破膜的试剂。4. 查看破膜试剂的特性,并确定它对表面待测靶标及相应荧光染料的影响。通过此步骤来确定表面染色这一环节是放在破膜前还是破膜后。5. 请切记,胞内染色本来就不是一个简单的过程,每个不同的panel都需要反复的摸索尝试,从而才能得到最佳的染色步骤,获得理想的染色效果。
Q17:“ CST关于胞内染色的经验分享可以在哪里找?”
A:可以在以下链接cst-science.com/flow-compatibility ,查找抗体克隆信息和实验步骤兼容性测试信息。

四、最后灵魂三问的总结

Q18:“ 为什么我的样本标记不上抗体?”
A:1.确定使用的抗体是可以用于流式实验的。2. 不同的实验步骤(尤其是固定破膜的方法)可能会影响抗体的性能及蛋白的构象。3. 如果有可能,请尽量了解靶标蛋白的生物学特性。
Q19:“ 怎么才能让样本标记上抗体?”
A:1.使用抗体说明书中已验证过的实验方案。2. 一个抗体可能有不同的实验方法,针对抗体的抗原位点及实验,选择最适的方法3. 胞内抗体需要破膜,不同抗体的破膜剂需要反复摸索后确认。
Q20:“ 胞内蛋白与CD分子同时标记时需注意什么?”
A:1. 确定CD分子的克隆,选择最适的固定破膜剂。2. 部分破膜剂会造成荧光基团的淬灭,组合选择合适的荧光基团与破膜剂。3. 确定CD分子标记的最佳环节。

此次讲座,收获好评无数——

“老师,讲的真好”

“请问有回放吗?”

“好厉害呀,照片也很好看,很专业哦”

“好专业啊”

“请问这个ppt可以会后分享一下吗?

“每次讲座真精彩”

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